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明治11年夏天，维新重臣大久保利通突遭暗杀。在这起事件背后，前维新志士志志雄真实（池田政典 配音）的身影渐渐浮现。当年他曾接任剑心担任刽子手，却最终遭到维新政府的背叛险致丧命。从地狱活转过来的志志雄，如今开始慢慢揭开“京都破坏计划”的黑幕。为了阻止志志颠覆明治政府的阴谋，密探集团——京都御庭番众的首领•翁交给遗孤少女卷町操（樱井智 配音）一项重要的任务，命她前去寻找曾经暗中支持着明治维新的刽子手拔刀斋——绯村剑心（凉风真世 配音）。操独自来到东海道，意外得知了心上人四乃森苍紫（安原义人 配音）的消息，
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时间设定在明治时期的新撰组。组员中的3个人都是女孩——性格大跳、男孩子气、无厘头却有着悲伤往事的组长近藤勇子；为了讨伐父亲的敌人：山县有朋而秘密加入新撰组的土方岁绘；性格外向，会使阴阳术和耍二刀流的高手冲田熏。OVA剧情：唯一的一个为了为了还债而不得不加入新撰组的弓月·新太郎——自感正义但是脾气温顺，身兼参谋和帐务的职务。TV剧情：在明治的新京都，佩戴着[许可证]的妖怪也在四下飞奔，在得到由官方发放的许可证后，可以和人类一起生活。其中，有一个专门逮捕没有得到许可证的妖怪人，以此来捍卫京都的治安的集团在奋斗
